Kemampuan enzim ligase dari E. Coli yang
terinfeksi virus T4 Bakteriofage dalam proses penggabungan fragmen DNA
membentuk ikatan fosfodiester
oleh Wendi Anata
Pendahuluan
Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan
fragmen DNA lainnya. Ligasi merupakan pembentukan ikatan fosfodiester dari ujung-ujung 2
untai DNA. Dalam proses pengklonan, DNA asing dari suatu
makhluk hidup disambungkan dengan vector pengklonan, yakni dapat berupa plasmid, phage dan cosmid sebagai vektor untuk bakteri. Dalam proses
penyambungan(ligasi), faktor yang sangat berperan adalah enzim ligase. Enzim
ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA asing yang telah
dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert yang
berasal dari fragmen DNA asing dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian
pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen.
Terdapat 2 jenis reaksi ligasi, yaitu: Intermolekuler dimana ujung kedua molekul DNA saling bergabung dan
Intramolekuler dimana ujung
molekul DNA yang sama saling bergabung sehingga membentuk suatu sirkular.
T4 DNA Ligase
Enzim T4 DNA ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang
mempunyai ujung tidak rata, yang disebut dengan sticky end, dengan ujung rata (blunt
end). Untuk meligasi ujung rata, dibutuhkan konsentrasi enzim yang cukup
besar. Enzim T4 DNA ligase mengkatalisasi pembentukan ikatan kovalen antara
gula dengan phosphate dari nukleotida yang berdekatan, sehingga terbentuk
ikatan phospodiester dimana satu nukleotida memiliki ujung 5’ phosphate bebas
dan nukleotida yang lain memiliki ujung 3’gugus hidroksil. Dalam menggabungkan
dua fragmen DNA berbeda, enzim T4 DNA Ligase tidak membedakan darimana DNA
organisme tersebut berasal sehingga apapun organismenya maka fragmen DNA
tersebut dapat digabungkan. Ligasi berhasil bila kedua ujung fragmen DNA yang
akan disambungkan berkomplemen. Gabungan kedua fragmen ini menjadi satu disebut
dengan DNA Rekombinan.
Mekanisme T4 DNA Ligase dalam Penggabungan DNA
Pertama-tama,
terjadi hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP, dalam kasus ini
kofaktornya adalah ATP. Hidrolisis kofaktor ini menghasilkan enzim-adenylate
AMP yang berikatan kovalen dengan protein lysin pada sisi aktif enzim dengan
melepaskan pyrofosfat inorganic (PPi).
Kemudian, sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung
bebas 5’-fosfat yang berada pada nick
DNA. Ujung 3’-OH akan menyerang ikatan AMP-5’-fosfat. Dan, terbentuklah ikatan
fosfodiester antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan
melepaskan AMP dan enzim adenylate
Skema proses penggabungan DNA dalam suatu DNA Rekombinan adalah
sebagai berikut:
Secara ringkas, mekanisme penggabungan dua fragmen DNA dengan bantuan enzim T4 DNA Ligase terdiri dari tiga tahap sebagaimana skema diatas:
1.
Pembentukan sebuah ikatan kompleks kovalen
enzim-AMP yang dihubungkan dengan sebuah lysine
side-chain pada sisi aktif enzim.
2.
Proses pemindahan AMP ke 5’ phosphate dari
fragmen DNA
3.
Penyerangan pada ikatan AMP-DNA oleh 3’-OH menghasilkan
ikatan kovalen fosfodiester dan menghasilkan AMP
Proses ligasi memiliki suhu optimum pada 37°
Celsius(Primrose 2001). Suhu optimum dari enzim tersebut akan berpengaruh
terhadap kondisi proses penggabungan DNA dilakukan. Pada umumnya, penggabungan
DNA dengan bantuan enzim ligase dilakukan di suhu-suhu yang bervariasi. Namun,
pada beberapa kasus dilakukan pada suhu-suhu tertentu.
Daftar Pustaka
Anam,
Khairul. Laporan Praktikum Rekayasa Genetika Laporan III (DNA Rekombinan).
Program Studi Bioteknologi. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. 2010
Primrose. Principles of Gene Manipulation 6 Edition.
Blackwell Science. UK. 2001
No comments:
Post a Comment