Pemilihan dan Insersi Vektor ke dalam Agrobacterium LBA 4404 pada Rekayasa Tanaman Padi dengan gen MmCuZn-SOD

Pemilihan dan Insersi Vektor ke dalam Agrobacterium LBA 4404 pada Rekayasa Tanaman Padi dengan gen MmCuZn-SOD

Wendi Anata¹

¹Teknologi Bioproses, Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Indonesia

Abstrak

Media transfer yang biasa digunakan dalam metode kloning tanaman adalah Agrobacterium tumefaciens yang memiliki Ti-Plasmid. Salah satu bagian dalam Ti-Plasmid yang paling penting adalah T-DNA(Transferred DNA), yang ditransfer melalui bakteri agrobakterium penginfeksi kedalam inti sel tanaman yag terintegrasi dengan genom tanaman. Salah satu metode yang digunakan dalam mentransfer T-DNA ke genom tanaman adalah sistem vektor biner. Tahapan insersi pGreenII.000 ke dalam Agrobaterium adalah menyiapkan konstruksi desain primer gen MmCuZn-SOD, menambah situs restriksi, induksi ke bakteri E.coli DH5Alpha, dan menginduksikan ke dalam Agrobakterium LBA 4404 menggunakan metode Triparental Mating(TPM).

Kata Kunci

Vektor Biner, Kloning tanaman, pGreenII.000

DNA Transfer pada Kloning Tanaman

Media transfer yang biasa digunakan dalam metode kloning tanaman adalah Agrobacterium tumefaciens, selain itu juga dapat digunakan jenis lain dari kelas yang sama, yakni: Agrobacterium rhizogenes. Kedua jenis bakteri ini dapat menyebabkan penyakit crown gall dan hairy root pada tanaman. Akibatnya, tumbuhan yang terserang penyakit tersebut dapat mengalami penghambatan pertumbuhan.

Kemampuan bakteri menginfeksi tanaman disebabkan oleh adanya Ti-Plasmid. Ti-Plasmid memiliki ukuran yang cukup besar, yakni: 100kbp. Ti berarti ‘Tumor-inducing’ dan ada juga yang disebut dengan Ri yang artinya ‘Root-inducing’. Ilustrasi dari Ti-Plasmid dapat dilihat pada gambar diatas. Salah satu bagian dalam Ti-Plasmid yang paling penting adalah T-DNA(Transferred DNA), yang ditransfer melalui bakteri agrobakterium penginfeksi kedalam inti sel tanaman yag terintegrasi dengan genom tanaman. Transfer T-DNA tersebut bergantung pada vir region(jika didalam plasmid) atau chv(jika di dalam kromosom). Mereka diinduksi dalam respon ketika suatu tanaman mendapatkan ‘luka’ yang mengeluarkan berbagai senyawa seperti acetosyringone, alpha-hydroxyacetosyringone dan prekursor dari lignin, seperti coniferyl alcohol. Dalam Ti-Plasmid, T-DNA diapit oleh sekuen yang berulang yang memiliki sekitar 25 pasang basa, yang dinamakan border repeats(atau left dan right border). T-DNA mengandung sekuen dari onc gene(Tumor-inducing potential).  Mereka termasuk gen yang terlibat dalam sintesis hormon auksin dan sitokinin yang berperan dalam pertumbuhan sel tanaman. T-DNA juga mengandung enzim yang memproduksi asam amino konjugasi yang tidak biasa, nopaline dan octopine, biasa disebut secara kolektif dengan opine. Tanaman yang telah mengandung T-DNA akan mengekskresikan opine(yang tidak dapat dimanfaatkan untuk dirinya sendiri) dan dimanfaatkan oleh Agrobakterium pada sisi infeksi pada tanaman.

Vektor pada Kloning Tanaman

Prinsip Dasar

Prinsip dasar dari menggunakan Agrobakterium dalam metode kloning pada tanaman adalah menyisipkan DNA asing pada T-DNA dalam sel bakteri. Kemudian, bakteri tersebut dapat menginduksikan T-DNA yang telah mengandung DNA asing tersebut kedalam inti sel tanaman dan terintegrasi dengan genomnya. Terdapat dua kesulitan dalam hal ini, yakni: pertama, Ti-Plasmid memiliki ukuran yang cukup besar sehingga sulit dimodifikasi secara in vitro(sulit menentukan situs restriksinya) dan T-DNA yang mengandung gen yang menghambat pertumbuhan ketika T-DNA ditransfer ke dalam tanaman. Solusi dari permasalahan tersebut dapat menggunakan dua metode berikut:

Cointegrative Vector System

Permasalahan diatas dapat ditangani dengan metode Cointegrative Vector System. Metode ini menggunakan vektor intermediet yang dimanipulasi yang dapat membawa marker yang dipilih. Kemudian, vektor intermidiet yang telah dimodifikasi(disisipkan gen yang diinginkan), diinduksi ke dalam Agrobakterium yang mengandung Ti-Plasmid. Vektor  intermediet tidak dapat bereplikasi dalam Agrobakterium, namun ia dapat berpropagasi ke dalam sisi T-DNA pada Ti-Plasmid. Kemudian, Agrobakterium ditransformasikan ke dalam inti sel tanaman yang akan mentransfer T-DNA rekombinan kedalam inti sel tanaman. Untuk tanaman yang mengalami penghambatan pertumbuhan, maka gen-gen regulator yang menghambat pertumbuhan dalam Ti-Plasmid harus diinaktivasi. Namun, hal ini cukup kompleks, karena membutuhkan rekombinasi antara integrative vector dan Ti-Plasmid.

Binary Vector System

Untuk memudahkan permasalahan tersebut, digunakan sistem vektor biner. Sistem ini juga menggunakan vektor yang berukuran kecil yang dapat dimanipulasi secara in vitro. Tidak seperti Cointegrative Vector System, vektor binary memiliki border repeats. Gen asing disisipkan ke dalam vektor binary(diantara border repeats tersebut). Kemudian, bektor binary rekombinan tersebut diinduksikan ke dalam Agrobakterium yang mengandung Ti-Plasmid yang sudah dinon-aktifkan(sehingga tidak dapat ditransfer ke host). Ti-Plasmid memiliki fungsinya(melalui sisi vir) sehingga dapat mentransfer gen langsung ke genom tanaman). Selection akan memaksakan marker dalam vektor biner dibawa oleh T-DNA pada Ti-Plasmids. Agrobakterium akan mentransfer sisi pada vektor biner yang diapit oleh border repeats ke dalam genom tanaman. Ilustrasi sistem ini dijelasakan pada gambar berikut:

Vektor biner sendiri dapat memiliki dua buah origin of replication yang dapat bereplikasi di dua host, misal E.coli dan Agrobacterium. Namun, kadang vektor binermemiliki origin tunggal yang dapat juga bereplikasi di dua host.

Insersi vektor biner ke dalam Agrobacterium

Untuk memasukkan vektor biner yang terkandung didalam host perantara(E.coli) ke dalam Agrobakterium dapat dilakukan dengan elektroforasi dengan naked DNA. Selain itu, dapat dilakukan dengan melakukan konjugasi dari inang perantara ke Agrobakterium dengan menggunakan metode TPM(Triparentang Mating), yang membutuhkan tiga bakteri, yakni: bakteri pembawa vektor binary rekombinan, bakteri agrobakterium sebagai inang, dan bakteri helper yang mengkondisikan terjadinya perpindahan vektor secara konjugasi.

Pemilihan Vektor dan Insersi ke Agrobacterium LBA 4404

Vektor pGreenII.000

Vektor pGreenII.000 merupkan vektor biner sintesis yang dapat melakukan replikasi dalam dua host karena memiliki dua oRi. Vektor pGreenII.000 ini memiliki ukuran 3.3 kb yang membuatnya mudah dimanipulasi secara in vitro. Vektor plasmid pGreenII.000 ini kami pilih dengan pertimbangan antara lain:

1.    Memiliki origin of replication, sebagai syarat replikasi. Vektor pGreenII.000  ini memiliki dua buah origin of replication yang bernama CoIEI dan pSa-ORI

2.    Memiliki daerah penempelan yang sesuai.

3.    Mempunyai gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inangnya nanti.

4.    Ukuran yang sesuai, memiliki ukuran yang relatif sedang dibandingkan dengan pori dinding sel inang.

5.    Memiliki lacZ yang terdiri dari multiple cloning site (MCS) dalam menjalankan fungsinya.

6.    Memiliki border repeats yang menandakan situs yang akan ditransformasi ke dalam tanaman.

7.    Memiliki selectable marker hyg^R(hygromicyn resistance) dalam lacZ yang membuat selection dalam sel tanaman nantinya.

8.    Memiliki nptI, yang berfungsi dalam propagasi ke Agrobakterium.

9.    Memiliki promoter nopaline synthase (nos), octopine synthase (ocs) and mannopine synthase (mas).

Konstruksi Vektor pGreenII.000
Desain Primer

Fragmen MmCuZn-SOD diperoleh dengan mengamplifikasi plasmid rekombinan pGEM-MmCuZn-SOD dengan primer spesifik:

• ·      MmSODXba-F : 5’-GCTCTAGAATGGTGAAGGCTGTGGTTGTTC-3’(Primer Foward)

• ·      MmSODSpe-R : 5’-GACTAGTTTAACCCTGGAGACCAATG-3’(Primer Reverse)

Primer didesain memiliki situs pemotongan enzim restriksi XbaI untuk primer forward dan site pemotongan SpeI untuk primer reverse.(Saleha, 2012). Sementara itu, plasmid pGreenII.000 dipotong dengan menggunakan enzim restriksi yang sama dengan situs restriksi MmCuZn-SOD, yakni XbaI dan SpeI pada bagian MCSnya. Setelah itu, dilakukan penyambungan plasmid pGreenII.000 dan gen MmCuZn-SOD dengan menggunakan enzim T4 DNA Ligase.

Tahapan Insersi Vektor pGreenII.000 ke dalam Agrobacterium LBA 4404 dengan Sistem Vektor Biner

Plasmid pGreenII.000 rekombinan tersebut diinduksikan kedalam inang perantara ke dalam bakteri E.coli DH5Alpha. Setelah plasmid pGreenII.000 rekombinan tersebut sudah terverifikasi dengan menggunakan PCR, maka dilakukan transfer plasmid secara konjugasi dari E.coli DH5Alpha ke dalam Agrobakterium dengan menggunakan metode TPM(Triparental Mating).

Metode Triparental Mating(TPM)

Transformasi menggunakan 3 macam bakteri yaitu E.coli DH5Alpha yang mengandung plasmid pGreenII.000 rekombinan (mengandung gen MmCuZn-SOD), bakteri E.coli HB 101 yang mengandung helper pRK 2013 sebagai pengkondisi terjadinya perpindahan konjugasi, dan A. tumefaciens LBA 4404 sebagai inangnya. Masing-masing bakteri dibiakkan pada medium LB padat dengan penambahan antibiotik kanamisin untuk bakteri E.coli dan streptomisin. Inkubasi E.coli DH5Alpha dilakukan selama 16 jam pada suhu 37°C dan Agrobakterium selama 32 jam pada suhu 28°C. Kemudian, masing-masing biakan diambil satu goreng dan dilarutkan dalam medium LB cair. Selanjutnya, masing-masing biakan dicampur secara berurutan: E.coli DH5Alpha, E.coli HB 101, A. tumefaciens LBA 4404. Lalu, diinkubasi selama 32 jam pada suhu 28°C. Hasilnya akan terjadi proses perpindahan secara konjugasi plasmid pGreenII.000 rekombinan ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA 4404.

Referensi

Hannum, Saleha. 2012. Isolasi, Pengklonan, Dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) DARI Melastoma malabathricum L. IPB. Bogor

J, Howe. 2007. Gene Cloning dan Manipulating Second Edition. UK: Cambridge University Press

S, Primrose. 2003. Principle of Gene Manipulation Sixth Edition. USA: Blackwell Science